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豬偽狂犬病毒PCR檢測(cè)試劑盒

產(chǎn)品編號(hào):SP010

檢測(cè)方法:PCR檢測(cè)

檢測(cè)樣品:血液或組織

規(guī)格:25T/50T


  

豬偽狂犬病毒PCR檢測(cè)試劑盒




【產(chǎn)品名稱】

通用名稱:豬偽狂犬病毒PCR檢測(cè)試劑盒

英文名稱:Porcine Pseudorabies virus PCR Detection Kit

 

【包裝規(guī)格】10頭份/ 50頭份/

 

【預(yù)期用途】

本試劑盒適用于豬偽狂犬病毒檢測(cè),不進(jìn)行病毒分型,對(duì)豬偽狂犬病毒引起的流感及其并發(fā)癥的診斷及療效評(píng)估有重要指導(dǎo)意義。

 

【檢驗(yàn)原理】

利用離心柱內(nèi)硅基質(zhì)膜提取DNA,在TaqDNA聚合酶的作用下,經(jīng)高溫變性、低溫退火、中溫延伸的循環(huán),使特異DNA片段的拷貝數(shù)放大一倍。經(jīng)過35次循環(huán),最終使擴(kuò)增DNA片段放大了數(shù)百萬倍。將擴(kuò)增DNA片段進(jìn)行電泳,經(jīng)染色后,在紫外燈照射下,肉眼可見到DNA片段的擴(kuò)增帶。

 

【主要組成成份】

組成

10頭份/

50頭份/

PPRV PCR反應(yīng)液

150 μL×1

750 μL×1

PPRV 混合酶液

30 μL×1

150 μL×1

PPRV 陽性對(duì)照

40 μL×1

40 μL×1

PPRV 陰性對(duì)照

40 μL×1

40 μL×1

0.2 mL薄壁PCR

12個(gè)

60個(gè)

50TAE電泳緩沖液(50倍稀釋后使用)

20 ml

100 ml

染色液

20 μL

50 μL

上樣緩沖液

40 μL

200 μL

制備管

10個(gè)

50個(gè)

2 ml 離心管

20個(gè)

100個(gè)

1.5 ml 離心管

10個(gè)

50個(gè)

Buffer V-L(病毒裂解液)

2.4 ml

12 ml

Buffer V-N(蛋白去除液)

0.8 ml

4 ml

Buffer W1A concentrate(洗滌液)

4.8 ml

24 ml

Buffer W2 concentrate(去鹽液)

4.8 ml

24 ml

Buffer TEnuclease-free

0.8 ml

4 ml

說明書

1

1

注:陰性對(duì)照為豬基因組DNA,陽性對(duì)照為PPRV經(jīng)滅活處理的核酸提取物。

 

【儲(chǔ)存條件及有效期】-20℃以下保存,避免反復(fù)凍融,有效期12個(gè)月。

 

【需自備的物品】

1.儀器:分析天平、離心機(jī)、PCR擴(kuò)增儀、電泳儀、電泳槽、紫外凝膠成像儀(或紫外分析儀)、微波爐、-20 ℃冰箱、可調(diào)移液器(2 μL、20 μL、200 μL、1000 μL)。

2.耗材:眼科剪、眼科鑷、稱量紙、20 mL一次性注射器、生理鹽水、瓊脂糖、500 mL量筒、500 mL錐形瓶、經(jīng)焦碳酸二乙酯(DEPC)水處理的滅菌1.5mL離心管和吸頭(10 μL、200 μL1000 μL)、滅菌雙蒸水。

 

【注意事項(xiàng)】

1.病毒具有很強(qiáng)的感染能力,操作前必須準(zhǔn)備好各種防御措施。

2.操作時(shí)須嚴(yán)格按照步驟進(jìn)行,廢物必須放入含消毒液的廢物缸,以免污染實(shí)驗(yàn)室和工作人員。

3.為避免其他核酸的污染而出現(xiàn)假陽性,必須使用不含DNARNA的離心管、吸管、槍頭、試劑和手套,操作人員須戴口罩。

4.Buffer V-LBuffer V-NBuffer W1A含刺激性化合物,操作時(shí)要戴乳膠手套和眼鏡,避免沾染皮膚、眼睛和衣服,謹(jǐn)防吸入口鼻。

 

【實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備】

第一次使用時(shí),請(qǐng)?jiān)?/span>Buffer W1 ABuffer W2 concentrate中按試劑瓶上指定的體積加入無水乙醇;

準(zhǔn)備異丙醇(1%冰乙酸):即99ml異丙醇中加入1ml冰乙酸,混合均勻,室溫密閉儲(chǔ)存;

如果是提取病毒RNA,請(qǐng)選用RNase free Tip槍頭和1.5 ml離心管或?qū)岊^和離心管用0.1% DEPC水處理后再使用。

 

【操作步驟】

1.樣品處理:每份樣品分別處理。

1. 新鮮采集的咽拭子、鼻拭子和糞便標(biāo)本,并使用滅菌生理鹽水懸浮。

2. 標(biāo)本收集后若不能立即檢測(cè),可置于28℃冷藏過夜保存;如需長(zhǎng)期保存,標(biāo)本應(yīng)凍存于-20℃-80℃

3. 標(biāo)本保存期間應(yīng)避免反復(fù)凍融。

2. 提取過程:

1)向上一步轉(zhuǎn)入樣品的1.5 mL的離心管中,加入200 μL Buffer V-L,渦旋振蕩混合均勻,靜置5 min。

2)加入75 μL Buffer V-N,渦旋振蕩混合均勻后,于12,000 rpm離心5 min

3)將上清液轉(zhuǎn)移到新的2mL離心管(試劑盒內(nèi)已提供)中,加300 μL異丙醇(1%冰乙酸),上下倒置6-8次,混合均勻。

4)將制備管置于2ml離心管(試劑盒內(nèi)提供)中,取上一步驟中的混合液移入制備管中,6,000 rpm離心1 min。

5)棄濾液,將制備管放回到2 ml離心管中,加入500 μL Buffer W1A(確認(rèn)已按要求加入無水乙醇),室溫靜置1min,于12,000rpm離心1 min。

6)棄濾液,將制備管放回到2 ml離心管中,加入800 μL Buffer W2(確認(rèn)已按要求加入無水乙醇),于12,000 rpm離心1 min。

7)將制備管放回到2 ml離心管中,12,000 rpm離心1 min。

8)將制備管置于潔凈的1.5 ml離心管(試劑盒內(nèi)已提供)中,在制備管膜中央加入40-60 μL Buffer TEnuclease-free),室溫靜置1min,于12,000rpm離心1-2min洗脫DNA/RNA。

注:洗脫體積越大,洗脫效率越高。如果需要DNA/RNA濃度較高,可以將洗脫的DNA/RNA再次過柱離心洗脫一次;或適當(dāng)減少洗脫體積, 但是最小體積不應(yīng)少于30 μl,體積過小降低洗脫效率,減少RNA產(chǎn)量。

3. PCR擴(kuò)增

每份總體積20 μL,含15 μL PCR反應(yīng)液(用前混勻),3μL 混合酶液,2 μL模板DNA。

例如:n份樣品,配制n+1份,15×n+1PCR反應(yīng)液, n+1)混合酶液勻后取18 μL分裝成n份,分別加入2 μL模板DNA,作好標(biāo)記。

PCR擴(kuò)增儀上進(jìn)行以下程序: 94 ℃ 3 min;循環(huán)94℃ 30 s,55 ℃ 30 s,72 ℃ 30 s,共35次;再72 ℃延伸7 min。

4. 電泳

1.5 g瓊脂糖放于500 mL錐形瓶中,加入50倍稀釋的TAE電泳緩沖液100 mL(取2 mL 50TAE電泳緩沖液,用雙蒸水稀釋至100 mL),于微波爐中熔解,再加入50 μL染色液混勻。在電泳槽內(nèi)放好梳子,倒入瓊脂糖凝膠,待凝固后將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物10 μL點(diǎn)樣于瓊脂糖凝膠孔中,以110120V電壓于50倍稀釋的TAE電泳緩沖液中電泳,紫外燈下觀察結(jié)果。

 

【結(jié)果判定】

陽性對(duì)照出現(xiàn)242 bp擴(kuò)增帶、陰性對(duì)照無帶出現(xiàn)(引物帶除外)時(shí),實(shí)驗(yàn)結(jié)果成立。被檢樣品出現(xiàn)242 bp擴(kuò)增帶為豬偽狂犬病毒陽性,否則為陰性。

 


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