【產(chǎn)品名稱】新型冠狀病毒PCR檢測試劑盒

【包裝規(guī)格】50T/盒

【使用范圍】該試劑盒用于使用咽拭子，鼻咽拭子，肺泡灌洗液，痰液樣品定性檢測新型冠狀病毒（2019-nCoV）。該試劑盒的檢測結果僅供臨床參考，不應作為臨床診斷的唯一標準。建議結合患者的臨床表現(xiàn)和其他實驗室檢查對病情進行全面分析。

【測試原理】該試劑盒基于一步式RT-PCR技術。選擇2019年新型冠狀病毒（2019-nCoV）ORF1ab和N基因作為擴增目標區(qū)域。設計了特異性引物和熒光探針（N基因探針用FAM標記，ORF1ab探針用HEX標記），用于檢測樣品中的2019年新型冠狀病毒RNA。該試劑盒還包括一個內源性內部控制檢測系統(tǒng)（內部控制基因探針標記有CY5），用于監(jiān)測樣本收集，RNA和PCR擴增的過程，從而減少假陰性結果。

【主要成分】

自備試劑：RNA提取或純化試劑。

陰性/陽性對照：陽性對照是包含靶標片段的RNA，陰性對照是無核酸水。在使用過程中，它們應參與提取，并應被視為傳染性物質。它們應按照有關規(guī)定進行處理和處置。

內參基因為人RnaseP基因。

【保存條件和有效期】-20±5℃，有效期6個月，反復凍融次數(shù)不應超過5次。

【適用儀器】擁有FAM/HEX/CY5等多通道熒光PCR儀。

【標本要求】

1.適用的樣本類型：鼻/咽拭子、痰、肺泡灌洗液。

2.標本采集（無菌技術）

咽拭子：同時用兩根拭子擦拭扁桃體和咽后壁，然后將拭子頭浸入裝有采樣液的試管中；

痰：患者深咳后，將咳嗽的痰收集在裝有采樣液的螺帽試管中；

肺泡灌洗液：由專業(yè)的醫(yī)務人員進行采集。

3.樣品的儲存和運輸

用于病毒分離和RNA檢測的標本應盡快進行測試。24小時內可檢測到的標本可在4℃下保存；那些在24小時內無法檢測到的物品應存放在-70℃或以下（如果沒有-70℃的存放條件，則應暫時存放在-20℃冰箱中）。標本應避免在運輸過程中反復凍結和解凍。標本應在收集后盡快送到實驗室。如果樣品需要長距離運輸，建議使用干冰進行存儲。

【測試方法】

1  樣本處理和RNA提?。颖咎幚韰^(qū)）

建議取200μl液體樣品進行RNA提取，相關提取步驟參照商品化RNA提取試劑盒說明書進行操作。該試劑盒中的陰性和陰性對照均參與提取。

2  PCR試劑制備（試劑制備區(qū)）

2.1  從試劑盒中取出所有組份在室溫解凍后，搖動并混合。使用前以8,000 rpm離心幾秒鐘；計算試劑所需量，反應體系配制見下表：

2.2  徹底混合各組分后，短時間離心以使管壁上的所有液體落到管底部，然后將20 μl擴增系統(tǒng)等分到PCR管中

3  采樣（標本準備區(qū)）

分別添加5μl提取后陰、陽性對照，待測標本的RNA到PCR反應管中，蓋緊管，并在8,000 rpm離心數(shù)秒后，將其轉移至擴增檢測區(qū)域。

4  PCR擴增（擴增檢測區(qū)）

4.1將反應管放入儀器的樣品池中，參數(shù)設定如下：

5  結果分析（請參考各儀器的使用說明書進行設置）

反應后，保存結果。分析后根據(jù)圖像調整基準線的起始值，終止值和閾值（用戶可以根據(jù)實際情況進行調整，起始值可以設置為3?15，終止值可以設置為5?20，調整）在對數(shù)圖窗口的閾值處，使閾值線處于對數(shù)階段，陰性對照的擴增曲線為直線或低于閾值線）。

6  質量控制

陰性對照：FAM、HEX、CY5檢測通道沒有明顯的擴增曲線;

nCOV陽性對照：FAM和HEX檢測通道的明顯擴增曲線，Ct值≤32；

在同一實驗中必須同時滿足以上要求；否則，該實驗無效，需要再次進行。

7  結果的確定

7.1  若測試樣品的FAM和HEX通道中沒有擴增曲線或Ct值> 40，CY5通道中存在擴增曲線，則可以判斷樣品中沒有新型冠狀病毒（2019-nCoV）RNA；

7.2   若測試樣品為人真實樣本且FAM、HEX和CY5通道中均沒有擴增曲線或Ct值> 40，則可以判斷此次實驗無效，需重新測試；

7.3   若測試樣品在FAM和HEX通道中具有明顯的擴增曲線，且Ct值≤40，則可以判斷該樣品對新型冠狀病毒（2019-nCoV）呈陽性。

7.4  若測試樣品僅在FAM或HEX的一個通道中具有明顯的擴增曲線，且Ct值≤40，而另一個通道中沒有擴增曲線，則需要重新測試結果。如果重新測試結果一致，則可以判斷該樣品對新型冠狀病毒（2019-nCoV）呈陽性。如果重新測試結果是否定的，則可以判斷該樣品對新型冠狀病毒（2019-nCoV）呈陰性。

【測試結果的解釋】

1.每次實驗均應測試陰性和陽性對照。只有當對照滿足質量控制要求時，才能確定測試結果

2.當FAM和HEX檢測通道為正時，由于系統(tǒng)競爭，來自CY5通道（內部控制通道）的結果可能為負。

3.當內部控制結果為負時，如果試管的FAM和HEX檢測通道也為負，則表明系統(tǒng)被禁止或操作錯誤，則測試無效。因此，樣品需要重新測試。

【測試方法的局限性】

1.樣品測試結果與樣品采集，處理，運輸和存儲的質量有關。不合理的樣品采集，轉移，存儲和處理可能會導致錯誤的測試結果。

2.樣品處理過程中交叉污染控制不佳，可能會出現(xiàn)假陽性結果。

3.在流行期間，病毒的基因突變也可能導致假陰性結果。

4.此試劑盒的測試結果僅供臨床參考。應結合患者的癥狀/體征，病史，其他實驗室檢查和治療反應來考慮患者的臨床診斷和治療。

【產(chǎn)品性能指標】

產(chǎn)品分析性能評估結果：

1  該試劑盒的分析靈敏度為103拷貝/ ml。

2.交叉反應：不與其他病原體發(fā)生交叉反應，例如地方性人類冠狀病毒（HKU1，OC43，NL63和229E）、H1N1（新型甲型H1N1流感病毒（2009）、季節(jié)性H1N1流感病毒、白色念珠菌、金黃色葡萄球菌、人類基因組DNA與2019年新型冠狀病毒相似或引起類似癥狀。

3.外源性干擾物質：標本中針對患者可能使用的治療藥物，如粘蛋白，苯福林、羥甲唑啉、氯化鈉（含防腐劑）、倍氯美松、地塞米松、曲安奈德、布地奈德、莫米松、氟替卡松、α-干擾素、扎那米韋、利巴韋林、奧司他韋、阿奇霉素、頭孢曲松、左氧氟沙星、妥布霉素均不會干擾試劑盒的測試結果。

4.痰和咽拭子標本中可能存在的內源性物質，例如全血和粘液，不會影響試劑盒的測試結果。

5.精度：批內/批間精度，日內/日常精度，不同操作者之間的精度變異系數(shù)（CV）不大于5％。

6.陰性/陽性參照物的符合率：3種陽性參照物和10種陰性參照物的符合率均為100％。

7.將臨床評價結果與通過新型冠狀病毒感染的肺炎患者診治方案和通過新型冠狀病毒感染的肺炎患者監(jiān)測方案（第二版）中通過推薦方法獲得的確認/排除結果進行比較。分析了解放軍總醫(yī)院海南醫(yī)院，廣東省疾病預防控制中心等8家醫(yī)療機構的實際使用情況。通過初步分析，基本確定了該產(chǎn)品的臨床性能可以滿足流行情況的緊急需求。用于臨床評估的樣品類型包括咽拭子和痰液。產(chǎn)品上市后將收集更多臨床數(shù)據(jù)，以確認其臨床性能。

【注意事項】

1  本產(chǎn)品僅用于體外測試。實驗前請仔細閱讀說明。

2  為了避免樣本中任何潛在的生物危害，應將樣本視為具有傳染性，并避免與人體皮膚和粘膜接觸；標本應在生物安全柜中處理，以防止氣溶膠流出。樣品制備區(qū)域中使用的試管和尖端應倒入盛有消毒劑的容器中，并與醫(yī)療廢物一起消毒后再丟棄。樣品處理和加工必須符合當?shù)叵嚓P規(guī)定。

3  產(chǎn)品加工：PCR后，該產(chǎn)品很可能造成污染。所有的反應管應由當天不再參與實驗的人員放入生物安全垃圾處理袋或其他容器中，然后在完全密封后丟棄。

4  在整個過程中避免RNase污染。實驗期間，請穿著工作服，一次性手套和口罩。在通風良好的化學通風櫥或生物安全柜中完成操作，該柜要用紫外線清潔，消毒和滅菌，以防止任何有害物質進入呼吸道。

5  使用高壓滅菌的一次性離心管和吸頭，或購買無DNase和RNase的離心管和吸頭。

6  使用前要完全解凍PCR檢測試劑，并在8000 rpm離心幾秒鐘后使用，但要避免反復凍融。

7  如果在樣品處理過程中不能很好地控制交叉污染，則可能會出現(xiàn)假陽性結果。

8  實驗室管理應嚴格按照PCR基因擴增實驗室的管理規(guī)范進行。實驗室人員必須接受專業(yè)培訓。實驗過程應嚴格劃分為不同區(qū)域（試劑制備區(qū)，標本制備區(qū)，擴增試驗區(qū)）。所有消耗品均應消毒一次使用。實驗的每個階段均應使用專用儀器和設備。每個階段的每個區(qū)域的用品都不得交叉使用。

9  實驗結束后，應使用10％的次氯酸鹽或75％的酒精對工作臺和移液器進行消毒，然后將其置于紫外線下20-30分鐘。

10   RNA樣品提取完成后，建議立即進行下一個實驗。否則，請將提取物儲存在-20℃以便使用（24小時內）；

11  必須對每個實驗進行質量控制。

12  各種因素可能會導致試劑在存儲，運輸和使用過程中性能發(fā)生變化，例如不正確的存儲和運輸，非標準樣品采集，樣品處理和測試。請嚴格遵守說明。由于樣品采集過程的特征（例如，用棉簽采樣和病毒感染過程本身），可能由于采集的樣品不足而導致假陰性結果。因此，應結合其他臨床診斷和治療信息對檢測結果進行綜合判斷，必要時應進行重新檢測。